【儀表網 研發快訊】現代顯微成像技術的基石，建立于去除熒光在樣品中的散射技術上，典型如共聚焦、多光子、光片成像、三維結構光、組織透明化等。然而，基于光學的層切技術常常會帶來系統成本、時間分辨率與光毒性的提高，基于生物的層切技術又會帶來樣品處理復雜性的提高。此外，即使是最先進的光學成像技術，在面對深層樣本的成像中，依然會由于深層散射而產生離焦背景，影響精細生物結構的觀察。
為了提升各種場景下熒光成像的光學層切性能，北京大學未來技術學院席鵬教授、深圳大學屈軍樂教授合作團隊另辟蹊徑，通過計算機視覺與熒光顯微的融合提出了一種暗通道光學層切算法(Dark sectioning)，他們在Nature Methods雜志以長文(Article)的形式，發表題為《暗通道光學層切算法助力熒光圖像離焦背景去除》的研究論文。Dark sectioning僅用單幀圖像即可高效去除圖像的離焦背景，使顯微成像的信背比(SBR)和結構相似性(SSIM)得到大幅提升，為深部生物組織研究、病理診斷及深層活體動態觀測開辟全新可能。
圖1. (a, b)自然圖像與離焦圖像的暗通道先驗處理結果，(c)點拓展函數的大小差異導致暗通道圖像差異，以及(d)Dark sectioning處理前后的圖像對比。比例尺：4μm
Dark sectioning的提出受到自然圖像的暗通道去霧啟發。暗通道先驗理論被廣泛應用于自然圖像去霧任務中，暗通道被定義為圖像局部塊的最小值組成的圖像。在無霧圖像中，暗通道圖像幾乎為0，而在含霧圖像中，暗通道圖像呈全白分布。研究者發現，暗通道先驗還能區分單色圖像的在焦與離焦信息；同理，暗通道先驗也能區分熒光圖像的背景與在焦信息，這是由于在焦與離焦圖像點拓展函數大小的差異，如圖1。然而熒光圖像中的離焦背景和自然圖像的霧霾又有著不同：霧霾呈現全局均一性，且自然圖像的像素灰度值代表圖像信息；而離焦背景呈現局部波動性，且熒光圖像的像素灰度值代表熒光強度。自然圖像的暗通道去霧技術直接用于熒光圖像會帶來弱信號的丟失與背景的不完全去除，因此其并不直接適用于熒光圖像當中。
因此，研究者開發了適用熒光圖像的背景去除技術——暗通道光學層切(Dark sectioning)。Dark sectioning首先通過高低頻分離以保留圖像的弱小信號，僅將低頻部分進行去背景處理，并利用物理參數驅動生成的點擴展函數優化圖像塊尺寸，在背景去除的過程中，通過更低一級的低通濾波器模擬初始背景分布，從而定量化初始背景，最后通過迭代濾除進行單次或多次的背景去除以適用不同程度的背景場景。通過寬場-共聚焦，寬場-光層切，二維-三維結構光，單光子-雙光子的聯合交叉驗證，研究者證明了Dark sectioning能夠基于寬場圖像達到共聚焦/光層切/雙光子的成像效果，并且能夠在深層組織成像時進一步提升共聚焦/光層切/雙光子的光學層切能力。
研究者系統探索了Dark sectioning在多種不同光學顯微鏡硬件模態與重建/后處理算法中的應用場景，如圖2所示。研究者發現Dark sectioning不僅能夠適用于寬場成像，光片/光場成像，受激發射損耗成像，偏振成像等硬件模態，能夠提高光學層切與偏振解析能力；更適用于深度學習超分，熒光漲落成像、二維/三維結構光照明成像，反卷積等重建/后處理算法，能夠顯著降低二維/三維結構光照明成像偽影，并提升熒光漲落成像(SOFI/SACD)和反卷積的重建分辨率。
圖2. Dark sectioning適用于各類基于熒光的顯微成像系統與重建/后處理算法中，包括寬場成像，光片/光場成像，受激發射損耗成像，偏振成像，深度學習超分，光學波動成像、二維/三維結構光照明成像，反卷積算法等
通過計算機視覺與熒光顯微成像的組合創新，Dark sectioning無需額外的成像成本，極大地提升了各類熒光成像模態的層切性能。在未來，其有望集成于各類顯微技術當中實現實時去離焦成像，并成為結構光/光場/分割/解卷積/熒光漲落/深度學習等重建技術的通用預處理手段。值得注意的是，Dark sectioning由于簡單且高效的原理，其處理速度快且泛化性高，研究者為了進一步提高用戶友好性，提供了MATLAB程序/函數，基于Java的Fiji插件以及Exe版本的多平臺Dark sectioning軟件供不同用戶測試使用：https://github.com/Cao-ruijie/Dark-sectioning。
在本項工作中，席鵬、屈軍樂為該論文的共同通訊作者，北京大學未來技術學院博士生曹睿杰和北京大學未來技術學院已畢業的李雅寧博士為共同第一作者。此外，該工作還得到了華中科技大學費鵬課題組、清華大學吳嘉敏課題組、南方科技大學李依明課題組、北京大學李長輝課題組、北京大學盧閆曄課題組的重要支持與幫助。本工作得到了科技部重點研發專項、國家自然科學基金等項目的資助。
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