如何優化ELISA封閉步驟

來源：上海邦景實業有限公司 2025年12月18日 10:13

ELISA實驗中，微孔板表面在包被抗原或抗體后仍存在未被占據的結合位點。若不加以封閉，這些位點可能非特異性吸附后續加入的抗體，導致高背景信號甚至假陽性結果。因此，封閉是確保實驗成功的關鍵步驟之一。

關鍵優化維度

以下是優化ELISA封閉步驟的主要方面，涵蓋封閉劑選擇、條件設定及操作細節：

一、封閉劑的選擇

不同封閉劑各有優劣，需根據實驗體系選擇：

1、牛血清白蛋白（BSA）：適用于大多數情況，尤其推薦用于避免干擾或檢測樣本含脂質/溶血時。

2、脫脂奶粉：成本低，但可能含有內源性磷酸酶，存在交叉反應風險；若檢測系統涉及HRP或鏈霉親和素體系，應謹慎使用。

3、動物血清（如小牛血清）：封閉效果好，但可能引入非特異性抗體，建議濃度為5%，且需注意與二抗宿主同源問題。

4、特殊封閉劑：如酪蛋白、明膠（0.8%）或多聚物，可用于特定干擾場景，例如當BSA與檢測抗體有交叉反應時可用明膠替代。

維度	推薦選項	注意事項
常用封閉劑	1–5% BSA 或 5%脫脂奶粉	BSA更純凈，奶粉便宜但成分復雜
特殊需求	含高脂/溶血樣本 → 選BSA 防干擾 → 避免奶粉抗體與BSA交叉 → 改用明膠或無蛋白緩沖液	根據檢測系統調整
封閉液pH	使用與包被液一致的緩沖液（如pH9.6碳酸鹽緩沖液）	防止蛋白變性，保持結構穩定

補充說明：封閉液應現配現用，避免反復凍融或長期儲存導致失效；同時保持無菌操作，防止污染。

二、時間與溫度的控制

1、常規條件：37℃孵育30分鐘至2小時，適合快速實驗流程。

2、高背景樣本：可采用4℃過夜封閉，提升均勻性和封閉效率，顯著降低背景信號。

3、平衡考量：高溫雖加快反應，但可能引起蒸發或非特異性吸附增強；低溫則延長周期但結果更穩定。

4、操作規范

充分洗滌：封閉后需用含0.05% Tween-20的PBS（PBST）洗滌3次，每次1–2分鐘，chedi去除未結合的封閉劑。

避免干擾物質：如疊氮鈉會抑制HRP活性，不應在含酶標記系統的封閉液中使用。

試劑兼容性：不同品牌試劑盒可能對封閉條件有特殊要求，務必參考說明書執行。

建議

先做對比實驗：設置不同封閉劑（BSA vs 奶粉）、濃度梯度和時間條件，評估信噪比；

參考試劑盒說明書：不同品牌試劑盒對封閉條件可能有特定要求，務必查閱說明；

標準化流程：一旦確定zuiyou條件，應在后續實驗中保持一致，確保數據可重復性。

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